動植物樣品的采集及DNA樣品的提取（上）

1.動物樣品的采集及處理方法 
       遺傳學數據在野生動物和圈養動物的保護和管理中變得日益重要。在本文中，我們總結了一些能簡便而有效地獲得樣品及數據的方法。 
       我們在采集樣品之前，對將要進行的遺傳學分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，當采集地與實驗室有相當距離時，采集者常常要保存好樣品直到有合適的接受者或存放地，這就要求采集者應具備一定的經驗。 
       首先，所有樣品均應以個體序號進行標注，并且應寫上種名、性別、采樣者姓名以及采集日期，越詳盡越好，以便同一個體的不同類數據可以相互引用，另外，地理來源的標注也很重要，需要注明。對于野外捕獲的動物，有條件者在地圖上標明捕獲地及其經緯度。對圈養動物的每個野外捕獲種源都要有同樣的記錄和詳盡的譜系圖，因為譜系圖可用于計算近交系數。 
       總之，背景資料越詳細越好，即使不能得到這里所列的全部信息，也要盡可能詳盡。 
 
 
1．1 樣品的測量方法 
在一定數量的分類群中采用的標準測量方法可用于以下四個方面： 
（1）分類學上：一套理想的測量方法應能大致上重建機體每個主要硬件部分的形狀和大小。 
（2）不對稱性分析：機體各部分的起伏不對稱，也許表明進化過程在一定程度上正在變得不穩定，這可能是環境壓力或近交的結果。測量不對稱時機體左右兩部分均應考慮在內。 
（3）遺傳變異：在科級水平上，如果對同一年齡的個體采用同樣的測量方法，就有可能對所選特征中的遺傳成分變異進行粗略的估計。雖然并非總是能做到這樣，但能使遺傳學家對所選特征（如生殖特征方面遺傳變異的任何丟失）進行監視。 
（4）生理檢測或記錄：采用標準測量方法得到的記錄，也許會有助于與用其他手段得到的數據起來分析。例如，如果有了形態的記錄，或是特殊寄生物的感染記錄，遺傳學家就能因此尋找在不同群體中這些因素與變異水平的相關性。 
 
 
1．2 組織樣品的采集和保存 
    下面詳細給出針對不同研究目的的適當方法。當然，每個實驗室都有各自習慣的組織處理方法，因此，本文僅給出快速保存的有關要求，但對每種組織的可用性都有所評述，以便在用途有沖突時，能對潛在數據的可能應用作出迅速判斷。  
 
    使用腫瘤、毛發及樣品，保存時應特別注意。使用細胞培養樣品可減少對活體或新殺動物的依賴，如果培養物來源于腫瘤組織細胞，則可大量減少對同種動物組織的進一步需求。組織材料必須在數小時內送到有關實驗室或用于其他的細胞培養。如果已經知道DNA 序列的一小部分，就可利用PCR 技術從很少一部分組織中擴增DNA，從而使極其的樣品（如一根毛發或單個）具有更高的利用價值和更大的可信度。 
組織必須取自活體動物或死后1～2 分鐘內的動物，并且要快速保存起來，除非出現下述情況：在野外條件或是匆忙安排的活體取樣，因此沒有時間同實驗室。此時要有目的地擴大采集和儲存量。如果已經詳細知道樣品的確切用途，則有時條件可以放寬。例如，對血液樣品來說，有些酶是不要求立即凍存的。快速凍存時樣品可放人液氮、干冰中或直接放入－70℃冰箱。凍存樣品可在—70℃液氮、冰箱、干冰或－20℃冰箱中保存和運輸。樣品凍存及運輸均以放入液氮中效果較好。非凍結冰箱是不能用的。 
 
1．2．l 用于染色體研究的軟組織的處理 
    室溫下將全部或部分樣品浸入0．9％的生理鹽水中，在數分鐘內將樣品送至實驗室，zui遲也要在1～2 小時之內送到。 
    研究染色體能看到有絲分裂和減數分裂，從而了解有關染色體倒位等現象。染色體倒位會影響到受精和遺傳重組，可能的同性個體應從染色體方面進行檢查，但對哺乳動物來說，通常不需要研究同性別的染色體。 
 
 
1．2．2 用于成纖維細胞培養的組織的處理 
    通常來源于幼體動物的組織用于細胞培養較好。在一個個體中，癌組織和肺組織是的，但其他軟組織也可以用。 
    細胞培養常用的是新鮮組織，但捕殺幾天后的動物組織仍能用來培養。總之，樣品越快到實驗室，成功的可能性就越大。 
    如果取樣時需切開活體動物的皮膚，則應當在無菌的條件下進行。對細胞培養來說，無  
菌條件下進行進一步的處理也是很有必要的，而在野外這是難以做到的。因此，一個不透風的封閉空間以及面具、手套是很有用的，至少操作人員應離開工作臺面遠一些。所有的臺面、試劑瓶、手套、儀器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的試劑應是新鮮的，如果對其無菌性有任何懷疑（如變渾濁或變顏色）就應倒掉。 
在無菌條件下將組織樣品放入0％的酒精中，搖動1 分鐘后，將樣品轉人收集液中，在室溫下放置1～4 天。如需放置更長時間，則兩天后須將組織樣品轉到運輸液中，就可再于室溫下存放幾天。轉移過程中無菌操作是很重要的，因為運輸液中一般不使用防腐劑。 
    收集液和運輸液一般由接受樣品的實驗室提供。成纖維細胞培養可生產出更多的材料而不必再從動物中取，達到事半功倍的效果。 
 
 
1．2．3 用于染色體研究的血樣的采集 
    采血樣須無菌操作。采血用的注射器、小瓶等應用肝素潤濕。有些用品買來時就已經用肝素處理過。迅速將血樣送往實驗室（在低溫條件下但不使其凍結）。如果條件不允許，可在無菌條件下，每 0．lml 血樣加 5ml 的血樣處理液，然后在室溫下轉送到實驗室（實驗室會有另一種準備好的處理液）。 
 
1．2．4 用于酶及其他蛋白質研究的軟組織的處理 
    將軟組織切成1cm 見方的小塊，包好并迅速凍存。如將組織塊浸泡在2％的苯甲醛中，在室溫下放置，某些酶的活性可保持幾個月（Nakanishi 等1969）。一些魚類蛋白質可以用市場買來的材料進行分析，但這里的目的是區分種，而不是為了獲得詳盡的遺傳數據。 
 
 
1．2．5 用于酶和蛋白質研究的血樣的采集 
    試驗所用的注射器、試管等應用肝素包被（是鋰鹽），或者是用低溫保存的肝素潤濕。如果可能的話，所有溶液配制等操作均應在5℃條件下快速完成。對于較大體積的樣品（＞5ml），將紅細胞、白細胞、血漿分開。首先在1000r／min 離心10 分鐘，快速吸取血漿，迅速分裝凍存。然后吸出漂浮在紅細胞表面的一層白細胞帶，再用5～10 倍體積的PBS 將紅細胞洗兩次后離心，zui后將片狀沉淀物快速凍存。 
    白細胞層用ACK 溶解（0．15mol／dm３ 氯化銨、0．01mol／dm３ 碳酸氫鉀、0．lmol／dm３ Na２ EDTA），直到變成澄清的紅色（約 5 分鐘）。在 500r／min 離心 5 分鐘后，小心吸去 ACK 和紅細胞碎片，剩下的白細胞會重新懸浮于 ACK 中。2 分鐘后，細胞成團沉淀，此時再用 PBS 洗。如果沉淀物仍為紅色，則將整個過程重復一次，而后將其凍存。白細胞（酶的來源）也可以通過將等分血樣鋪展于20％的Ficoll、4．5％Na２ EDTA中的方法，使其沉降（10～15 分鐘），再用巴氏吸管從界面吸取白細胞，于1000r／min 離心10 分鐘，而后凍存。用 Ficoll 分離的紅細胞很難再復原。 
    有些蛋白質可以用其他方式保存的血樣進行分析：①保存于5℃并在幾小時內送到實驗室的；②凍存的全血（未處理過）；③全血或經分離的血樣稀釋于3 倍體積的苯甲醛中，并保存于室溫下。蛋白質電泳是用于研究種群內遺傳多樣性或分類學差異的方法。同其他脊椎動物相比，哺乳動物血樣并非是很好的酶和蛋白質的來源，有時取軟組織更好。 
 
1．2．6 用于核DNA 研究的軟組織的保存 
    將組織切成1cm 見方的小塊，包起來凍存。或將其放入幾倍體積的80％乙醇（分析 
純）中，于4℃下存放。兩種方法中以前一種方法更好。 
 
 
1．2．7 用于核DNA 研究的血樣的保存保存血樣可用占血樣體積0．01 倍的15％ K２EDTA 作為抗凝劑，并且能夠加入0．05倍的蛋白酶K（0．1％，核酸級，Boehringer Mannheim 冰凍保存，用新解凍的），充分混合后迅速凍存。血與EDTA 混合液可在室溫下放置幾天，但DNA 的質量不會太好。 
DNA 技術可以分析幾乎所有組織樣品基因組的任何一部分，從而能夠克服用蛋白質研 究變異及分類學時出現的有關問題。 
 
1．2．8 用于制備DNA 的毛發及樣品的保存 
    雖然以前從干燥或用福爾馬林固定的毛發及樣品中提取過DNA，但zui可靠的保存方法是凍存（Impraim 等 1987；Thomas 等 1990）。必須注意的一點是，盡可能地減少其他來源的DNA 對樣品的污染，特別是實驗者的手，因為PCR 反應對微量DNA 是很敏感的。較好的做法是儀器經烘烤（180℃過夜）或火焰消毒，其他所用的每一件東西（手套、試管、工作臺面）用一套新的、經γ射線消毒處理的商業化產品。樣品也可以用來作常規的遺傳分析，如不需要人工控制交配就可進行連鎖研究（Li 等1988）。當然，樣品還可用于人工授精，這在圈養動物的遺傳管理上是很重要的。 
 
 
1．2．9 用于提取線粒體DNA 的軟組織及血樣的保存 
    將樣品在4℃下保存，并盡快送到實驗室。血樣貯存于有葡萄糖檸檬酸包被的真空管中時，可以凍存幾年（在液氮中），但解凍后只能在室溫下保存幾天時間。線粒體DNA 的分析對研究物種在地理分布上的變異及構建譜系尤其有用。 
 
1．2．10 用于提供RNA 的軟組織的保存 
    RNA 會在極短的時間內被破壞，因此必須在動物死亡或活檢后1～2 分鐘內迅速將其切成1cm 的小塊，并放人液氮中凍存。 
    RNA 可用于 DNA 文庫的構建，它能為遺傳學家提供探針，用于個體總DNA 中單個活性基因的分析。雖然來源于其他動物的探針也能用，但用同種的探針效果。 
 
 
2 動物組織DNA 樣品的提取 
    目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我們在這一部分中除了介紹常規的DNA提取方法外，還將著重討論由微量樣品（如毛發）和陳舊古老樣品提取DNA 的一些新方法。 
 
2．1提取動物總DNA 的常規方法 
    從動物組織中提取DNA 的常規步驟如下： 
（1）取動物組織100mg 左右于樣品管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎。 
（2）在樣品管中加入如下試劑： 
500μl STE 溶液 
25 μl 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mg／ml） 
75μl 10％ SDS 
（3）混勻后置56℃下消化2 小時以上（隔一定時間混勻一次）。 
（4）加人等體積的飽和酚溶液，輕輕顛倒混合5 分鐘以上（用于rDNA 和RAPD 分析的樣品需抽提24 小時）。 
（5）7 000r／min 離心5 分鐘。 
（6）小心將上層清液移至另一干凈的離心管中，加入等體積的*及，并重復步驟（4）和（5）的抽提過程。 
（7）以等體積的（內含1／25 體積的異戊醇）重復步驟（4）和（5）的抽提過程。 
（8）在上清液中加入 1／10 體積的 3mol／dm３NaAc 或 5mol／dm３NH４Ac、2 倍體積的冷無水乙醇或1 倍體積的異丙醇，以沉淀DNA。 
（9）置—70℃下沉淀2 小時或置—20℃下沉淀過夜。 
（10）7 000r／min 離心10 分鐘，再以 70％冷乙醇洗滌DNA 沉淀一次。將沉淀置真空干燥器或37℃溫箱中干燥。 
（11）以適量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 樣品。 
（12）以分光光度計測定DNA 的濃度（260nm），260／280nm 的光密度比值應在 1．8 以上，否則提示可能有蛋白質或*的污染。 
（13）以TE 溶液將DNA 樣品稀釋成所需的工作液的濃度。 
（14）取2μl 左右的樣品進行電泳檢測，以判斷 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。 
 
2．2 微量動物組織樣品的總DNA 提取方法 
    從微量組織中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）發展起來的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一種螯合劑）提取DNA。此方法簡便、快速，提取后的DNA 樣品可以直接作為PCR 的模板。具體的操作步驟如下： 
（1）取一小塊冰凍的組織（少于1mg，可用經消毒的槍頭鉆取），或1～3 根帶有毛根的毛發（需先經 90％、70％的乙醇和滅菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入經過高溫消毒的離心管中。離心管內事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。 
（2）將樣品管在56℃下放置1 小時或更長時間，直至組織樣品成粉末狀（不同組織所需時間各不相同）。 
（3）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。 
（4）在 95～100℃下煮 15～40 分鐘。 
（5）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。 
（6）將樣品管在4℃下保存，進行PCR 反應之前再次離心，使Chelex 顆粒沉淀。取上清液（1～10μl）作為DNA 模板。  
 
2．3 陳舊、古老DNA 樣品的提取方法 
    對于陳舊、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段從古埃及木乃伊中提取并測定了一段DNA 序列。然而，較為廣泛地開展對古老DNA 的研究是在多酶鏈式聚合反應（PCR）發明以后才開始的（Mullis，Fallona 1987）。 
    經過一定時期的物理、化學作用（幾十年至幾百萬年）的DNA 往往存在比較嚴重的降解，DNA 段常常僅有幾百個bp 的長度，并且可能存在堿基的修飾和一些抑制PCR 反應的物質。因此，在從陳舊或古老樣品中提取DNA 時，zui為關鍵的問題就是防止現代DNA 的污染。進行DNA 提取操作的所有器皿、器械和試劑均要進行滅菌處理，提取過程應在超凈臺中進行。此外，提取時應設陰性對照，以監測是否存在外源DNA 的污染。下面介紹的是一種較為簡便的提取方法。 
（1）取樣品少許（如哺乳動物的皮張可取 1cm × 1cm 見方的小塊），用剪刀、手術刀等器械對樣品表面進行處理，除去zui容易遭受外來污染的表層。對于骨骼、琥珀等堅硬的樣品則需要用小鋼鉆等特殊器械從內部取得樣品。 
（2）經過表面處理的樣品用90％乙醇、70％乙醇和去離子水依次進行清洗。 
（3）在滅菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去離子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 體積的（20μl）10％的β-巰琉基乙醇。處理過的樣品放入上述溶液前要盡可能剪碎。 
（4）在56℃下消化48 小時。 
（5）樣品管中加入等體積的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋渦混合器上振蕩5～10秒鐘，然后在98℃下放置20～60 分鐘。 
（6）振蕩混合5～10 秒鐘，并使之冷卻至室溫。 
（7）12 000r／min 離心 5～10 分鐘。 
（8）小心取出上層清液，置另一干凈的管中保存。